這項基因技術在癌癥疾病研究中變得越來越重要

Hi-C是2009年提出的染色體構象捕獲結合高通量測序的一種技術(Erez Lieberman-Aiden, et al,Science),是衍生于染色體構象捕獲技術(3C)的高通量技術,實現了全基因組范圍內的染色體片段間的相互作用的捕獲檢測。作為染色體三維構象與互作研究的利器,Hi-C技術廣泛應用于腫瘤/疾病發生發展機制、分化發育機制、畸變機制等研究。

同樣源于3C的用以研究染色體互作的技術還包括4C(“circular?3C”或“3C-on-Chip”)、5C(Chromosome?conformation?capture?carbon?copy)?、ChIA-PET(chromatin?interaction?analysis?by?paired-end?tag?sequencing)?,不同的3C衍生技術的區別在于捕獲的連接片段檢測和定量方式。

3C:經典的3C實驗中,通過基因座特異性引物PCR檢測單個連接產物,大多數3C通常僅能分析幾十到幾百Kb染色質之間的相互作用,通量低,費時費力——one?vs?one。

4C:使用反向PCR產生單基因座的全基因組相互作用圖,研究已知DNA片段(bait)與全基因組未知DNA片段之間的互作——one?vs?all。

5C:基于3C的基本原理,結合連接介導的擴增?(ligation-mediated?amplification,LMA)來增加3C檢測的通量,識別兩組大量位點之間并行的數百萬個相互作用,例如一組啟動子和一組遠端調控元件之間的互作——many?vs?many。

ChIA-PET:對感興趣的蛋白質結合位點之間的遠程互作進行全基因組分析。

Hi-C:提供了一個真正全基因組范圍的相互作用圖譜(該圖譜的分辨率取決于測序的深度)——all?vs?all。

 

Hi-C之技術流程

 

Hi-C的主要原理是將空間結構臨近的DNA片段進行交聯,并將交聯的DNA片段富集,然后進行高通量測序,對測序數據進行分析,即可揭示染色體片段間的交互信息,闡述染色體三維構象。

(Rao S S,et al.,Cell

Hi-C與普通二代測序(如全基因組重測序等)最大的區別在于前期建庫時對構象的固定與捕獲,Hi-C文庫制備流程主要包括甲醛交聯、細胞裂解、內切酶酶切、末端修復及生物素標記、片段連接、捕獲帶生物素標記的片段、文庫質檢等步驟。Hi-C文庫質量受多種因素影響,如細胞裂解劇烈程度、細胞裂解期間的蛋白酶抑制劑含量等,Hi-C文庫質量直接影響后續的有效數據產出。

因而Hi-C技術難度較高的主要難點就在于建庫,大多數公司在建庫這一環節就已經被排除門外,有些公司雖然能做但也可能需要多次建庫。作為高通量測序行業的領航者,百邁客Hi-C標準建庫流程已申請國家專利,我們致力于將Hi-C打造成類似于轉錄組一樣技術成熟的產品,成為功能基因研究的最佳幫手。

百邁客一直保持著近100%的建庫成功率,即使是次生代謝物種類較多的建庫難度大的植物,百邁客的一次建庫成功率在97%以上,不僅如此,憑借一定的技術優勢和項目經驗,BMK已經幫助客戶解決了某些Hi-C“疑難雜癥”,并最終助力客戶的科研進展。

合格的Hi-C文庫對于提升有效數據量具有重要作用,因此有效Hi-C數據量的高低會直接反映Hi-C文庫建庫質量的高低,主要從Valid?Interaction?Pairs含量對Hi-C數據進行評估。Invalid?Interaction?Pairs主要主要包含自連類型、末端懸掛類型等。Valid?Interaction?Pairs在30%以上即認為數據合格,根據已有項目經驗,百邁客動物樣品文庫的有效數據最高達86.68%。

Hi-C之研究內容

 

通過Hi-C技術可以獲得全基因組范圍內的互作信息,得到染色體三個層級的三維結構:A/B?compartment、拓撲相關結構域(TAD)、染色質環(loop)。

A/B?compartment

染色質劃分為A、B兩種compartments:

A?compartments:常染色質,松散染色質狀態、高基因密度、轉錄活躍區域,富集轉錄活性相關的表觀遺傳標記(例如H3K4me3)。

B?compartments:異染色質,壓縮染色質狀態、低基因密度區域、轉錄抑制區域,富集無轉錄活性的表觀遺傳標記(例如H3K27me3)。

A/B?compartments具有組織、時期、狀態特異性,在不同組織或不同時期或疾病狀態間能夠發生轉換,這種轉換和基因表達調控有一定關系。當染色體上某區域發生A/B?compartment轉化,會影響其中的基因的轉錄活性,通常B?compartment轉換為A?compartment的區域相關基因大多表達上調,而A?compartment轉換為B?compartment的區域相關基因則下調。

腫瘤細胞系與正常細胞系間A/B?compartment轉換(Pengze Wu1,et al,NC)

拓撲相關結構域(TAD)

拓撲相關結構域(topologically?associating?domains,TAD)是一段具有折疊結構的DNA序列,此區域內部的互作頻率會顯著高于毗鄰的兩個區域之間的互作頻率,TAD是基因組在空間結構中的基本組織形式。TAD結構在不同時空下(組織、發育階段、狀態等)具有一定的保守性,同時也有一些動態變化。

TAD邊界有明顯的界限,通常存在大量的絕緣子、管家基因等,其內部是一個獨立的調控單元,內部的基因存在協同表達特征;TAD邊界具有很有很重要作用,將邊界部分刪除后會使得基因調控變得紊亂,導致原來沉默的基因被轉錄,而原來應該轉錄的則沉默了。

腫瘤細胞系與正常細胞系的TAD(Pengze Wu1,et al,NC)

染色質環(loop)

DNA在CTCF等蛋白質的介導下形成遠距離互作,這種結構通常稱為loop結構。通過Hi-C可以檢測到線性距離很遠而空間距離被拉至很近的DNA片段,即peak位點,它們之間的交互頻率往往高于線性上相鄰的片段,以peak位點來確定loop位置。

同樣loop結構在不同時空下(組織、發育階段、狀態等)會有一些動態變化,且通過loop錨定的位點中包含啟動子、增強子、沉默子等,當發生loop結構的動態變化,如新形成或消失,在一定程度上會影響基因的調控。

loop與基因轉錄開/關(Rao S S,et al.,Cell,2014)

 

 

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