前沿|nanopore全長測序新方法nano-ID檢測新合成的isoform及其穩定性

本文為大家分享一個基于nanopore平臺檢測新合成isoform及其穩定性的技術。

真核基因通常產生多種RNA isoform,其可產生功能上不同的蛋白質變體。然而,RNA isoform的合成和穩定性鮮少了解。原因是目前量化RNA代謝的方法是不能檢測RNA isoform的“短讀長”測序。

因此作者開發了nano-ID(nanopore sequencing-based Isoform Dynamics ),其結合了代謝RNA標記、天然RNA分子的“長讀長”納米孔測序和機器學習。

一個主要挑戰是尋找合適的核苷類似物用于RNA標記和檢測標記的RNA isoform,已知標記效率限制在約2-3%,即100個天然核苷酸中只有2個或3個被核苷酸類似物取代。作者利用ERCC標準品,分別以添加核苷酸類似物和不添加的天然堿基作體外轉錄,將體外轉錄產物進行nanopore direct RNA測序,比較了幾種不同的核苷酸類似物:5EU(5-Ethynyluridine,5-乙炔基尿苷)、5BrU(5-bromouridine,5-溴尿苷)、5IU(5-iodouridine,5-碘尿苷)、4sU(4-thiouridine,4-硫代尿苷)和?6sG(6-thioguanine,6-硫鳥嘌呤)。最終結果表明:5EU和5IU標記檢出率比較高,且5EU對細胞無毒性。且5EU標記的新合成RNA中約有一半U可以被識別為5EU,且從原始電信號中可以明顯區分5EU和天然U堿基。選用5EU進行體內實驗。

整體的nano-ID方法如下,作者在人慢性髓系白血病細胞系K562中進行了體內研究:5EU處理60min組、5EU處理24h組和未處理組。同時,作者進行了polyA長度分析。

熱休克反應(42°C 60min)處理,許多RNA isoform改變了合成速率、穩定性和剪接模式。nano-ID分析結果表明,對于某一個基因座對應的組合RNA混合物(基因水平)的代謝變化與單一轉錄本代謝變化差異非常大。雖然組合的RNA穩定性與poly(A)尾巴長度相關,但是單個RNA isoform可以顯著偏離。nano-ID能夠在不同細胞狀態和條件下研究單個RNA分子和isoform水平的RNA代謝。

【參考文獻】

Maier K C, Gressel S, Cramer P, et al. Native molecule sequencing by nano-ID reveals synthesis and stability of RNA isoforms[J]. bioRxiv, 2019: 601856.

 

如果您的科研項目有問題,歡迎點擊下方按鈕咨詢我們。

 

最近文章
双色球 时时360走势图 北京pk10全天计划稳定 百盈快三的技巧规律 mg游戏网页游戏修改器 推牌9顺口溜 pk10软件破解 复式二中二表图 pk10赛车计划软件 三十六码网站 单机斗地主欢乐版免费 双色球人工计划在线 pt电子哪个平台好 pk10走势图软件下载 幸运飞艇计划分析 北京pk10冠军技巧